发布日期：2024-12-08 20:11 点击次数：114
萜类化合物种类旺盛，现已在当然界中发现特出8万种不同的结构，是现时含量最丰富的一类自然化合物。自然存在的萜类化合物被粗拙应用于医药、食物、化工等领域[1-3]。举例，青蒿素是最有用的抗疟疾药物陈凯歌 男同，紫杉醇、东谈主参皂苷可动作抗肿瘤药物[4-5]；番茄红素和虾青素因其具有抗氧化活性，被制奏效力性食物[6-10]；香叶醇、蒎烯、柠檬烯等则是伏击的香精香料，用于日化用品[11-15]。萜类化合物主要存在于植物和微生物中，散布粗拙，但含量极低。现时时通过植物索取、化学合成等步调获取。但是植物索取周期长、资本高，且索取步调繁琐、收率低[3， 16]。化学合成也存在反馈经由复杂、资本高、产率低及环境浑浊等问题。因此亟须迷惑新的坐蓐步调以振奋萜类化合物的市集需求。
跟着组学时间的发展，多量萜类化合物的生物合成路线徐徐被概念，通过合成生物学步调，即利用微生物细胞工场异源坐蓐自然萜类化合物已成为研究热门[17]。微生物孳生速率快、滋长周期短、发酵工艺熟悉、安全性高、不受征象影响，且居品易于索取分离，坐蓐资本低，因此迷惑微生物细胞工场坐蓐自然萜类化合物是搞定萜类物资稀缺的可行步调[3， 17]。频年来，通过构建合成路线主管微生物坐蓐萜类化合物的步调已得到粗拙应用。其中真核模式生物酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)具有遗传操作通俗、滋长所需养分物资价钱便宜、培养工艺省略、抗噬菌体感染、具有真核抒发修饰系统等上风，是多种自然居品高效合成的细胞工场。此外，与大肠杆菌(Escherichia coli)等细菌比拟，S. cerevisiae的甲羟戊酸路线(mevalonate pathway， MVA pathway)具有愈加饱和的异戊烯焦磷酸(isopentenyl diphosphate， IPP)和二甲基丙烯基二磷酸(dimethylallyl pyrophosphate， DMAPP)，可用于萜类前体的合成，何况S. cerevisiae具有更完善的翻译后修饰才能，更利于多种萜类物资合成经由中进行氧化反馈所需的细胞色素P450的抒发；与其他真菌比拟，S. cerevisiae是真核模式生物，遗传配景明晰、遗传操作熟悉、更易进行工程化校正[18]。因此，相较于其他工程菌，S. cerevisiae具有更多动作坐蓐萜类化合物的底盘细胞的上风，现已被粗拙用于研究代谢校正坐蓐多种萜类物资[18-20]。
本文要点先容了利用S. cerevisiae细胞坐蓐萜类化合物合成路线的构建与优化，系统文书了提升S. cerevisiae细胞中萜类化合物合成才能的计策，为S. cerevisiae中更多萜类化合物的高效合成提供新念念路。
1 萜类化合物异源合成路线的构建萜类化合物，又称类异戊二烯类化合物，是一类以异戊二烯五碳单位为碳骨架纠合起来的碳氢化合物。如图 1所示，所有的类异戊二烯都繁衍自五碳原子(C5)的IPP至极异构体DMAPP，在此基础上添加一个或多个五碳的异戊二烯单位，进而形成不同的类异戊二烯，并凭据含有的异戊二烯单位数目可将萜类化合物分为单萜(C10)、倍半萜(C15)、二萜(C20)、三萜(C30)、四萜(C40)、多萜等[5]。此外，萜类化合物不仅大略以萜烯的神色存在，还不错通过氧化反馈、复原反馈、环化作用、环冲突、碳重排等样式形成醇、醛、酯、酮、羧酸、甙等多种繁衍化合物[21]。
萜类化合物的生物合成路线较长，从乙酰辅酶A起程，经过MVA路线的7个反馈可荡漾为IPP和DMAPP[22-23](图 2)。随后IPP和DMAPP投入麦角甾醇合成路线合成牻牛儿基焦磷酸(geranyl pyrophosphate， GPP)、法尼基焦磷酸(farnesyl pyrophosphate， FPP)、牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(geranylgeranyl pyrophosphate， GGPP)、2， 3-氧化鲨烯等告成前体物资，GPP、FPP、GGPP、2， 3-氧化鲨烯在异源的萜类合成酶作用下生成一系列的萜类化合物。但并不是所有的三萜化合物的合成都需要经过麦角甾醇合成路线。2022年，Tao等[24]初度发现丝状真菌着手的Ⅰ型萜类合成酶的异戊烯基转机酶结构域大略告成催化IPP和DMAPP缩合生成六聚异戊烯基焦磷酸(hexaprenyl diphosphate， HexPP)，随后其萜类合酶结构域再催化HexPP环化生成非角烯鲨着手的三萜骨架。但现时对于这种非角鲨烯着手三萜骨架合成样式的研究并未几，因此本文主要磋商经麦角甾醇路线萜类化合物的生物合成和代谢调控，并记忆了频年来S. cerevisiae动作宿主菌合成萜类化合物的研究进展(表 1)。
2 合成路线优化萜类化合物合成波及乙酰辅酶A的生成，MVA路线，GPP、FPP、GGPP和2， 3-氧化鲨烯的合成，萜类合成酶的环化至极他修饰等。S. cerevisiae体内虽存在乙酰辅酶A合成路线、MVA路线，以及大略提供GPP、FPP等前体物资的麦角甾醇合成路线，具有合成萜类化合物的基础条款，但细胞内存在严格的调控机制，导致流向萜类化合物合成的代谢流量较少，合成萜类化合物的前体不及，极地面截至了细胞内萜类化合物的生物合成。通过代谢路线构建与优化、关键酶的挖掘与校正、辅因子再生工程、细胞区室化工程等技巧优化S. cerevisiae细胞中萜类合成路线，大略有用强化前体物资供应、增大合成路线代谢通量，是提升萜类化合物产量很伏击的步调。
2.1 强化前体物资供应 2.1.1 加多乙酰辅酶A供应乙酰辅酶A不仅是MVA路线的肇端反馈物以及萜类化合物合成的关键前体物资，亦然S. cerevisiae所有这个词代谢网罗中的伏击中间代谢物。乙酰辅酶A粗拙存在于线粒体、细胞质、细胞核和过氧化物酶体中，参与了甾醇和萜类合成、三羧酸轮回、脂肪酸代谢等多种伏击的生理代谢经由，同期乙酰辅酶A的散布呈现高度区室化，且各区室之间不成相互穿梭利用[12]。因此，提升S. cerevisiae中乙酰辅酶A供应水平，关键在于两点：一是校正内源的乙酰辅酶A合成路线和降解岔路，二是充分利用不同细胞器中的乙酰辅酶A。
如图 3所示，在细胞质中，葡萄糖经糖酵解路线生成丙酮酸，一部分丙酮酸投入线粒体，在丙酮酸脱氢酶复合体(pyruvate dehydrogenase， PDH)的催化作用下合成乙酰辅酶A，随后投入三羧酸轮回，并通过此经由开释能量，为所有这个词机体的运行提供能量[51]。一部分保留在细胞质中的丙酮酸投入丙酮酸脱羧酶岔路，在丙酮酸脱羧酶(pyruvate decarboxylase， PDC)的作用下生成乙醛，乙醛在乙醛脱氢酶(acetaldehyde dehydrogenase， ALD6)的作用下生成乙酸，乙酸在乙酰辅酶A合成酶(acetyl-CoA synthetase， ACS)的催化作用下进一步形成乙酰辅酶A[52]。部分乙酸投入细胞核，在ACS的催化作用下形成乙酰辅酶A，守护组卵白乙酰化修饰，并对DNA转录进行调控[53]。而部分乙酸在过氧化物酶体中形成的乙酰辅酶A在柠檬酸合酶(citrate synthase， CIT)的作用下投入乙醛酸轮回，胞质溶胶的乙酰辅酶A也不错通过与苹果酸合成酶(malate synthase， MLS)反馈投入乙醛酸轮回[54]。此外，乙酰辅酶A照旧脂肪酸合成的前体，参与脂肪酸的合成，同期亦然脂肪酸β-氧化的降解居品。
基于内源的乙酰辅酶A的合成路线和降解岔路对S. cerevisiae进行代谢工程校正以增强乙酰辅酶A的合成，是提升想象化合物的产量的伏击技巧。丙酮酸脱羧酶岔路中丙酮酸经丙酮酸脱羧酶PDC、乙醛脱氢酶ALD6、乙酰辅酶A合成酶ACS的催化作用生成乙酰辅酶A。Shiba等[55]过抒发ALD6，减少酒精的生成，提升乙酸的合成，从而增强了投入丙酮酸脱氢酶旁路的碳流量，在此基础上，过抒发S. cerevisiae内源的乙酰辅酶A合成酶ACS1，将紫穗槐二烯的产量提升了23%，而在引入了来自肠炎头陀氏菌(Salmonella enterica)的乙酰辅酶A合成酶变体SeACS后，过抒发ALD6和SeACS，使得乙酰辅酶A的合成量提升3.2倍，加多了投入MVA路线的乙酰辅酶A，进而将紫穗槐二烯产量提升了约4倍。Lian等[56]为了加多乙酰辅酶A的供应，敲除甘油-3-磷酸脱氢酶(glycerol-3-phosphatedehydrogenase， GPDH)基因gpd1和gpd2以提升糖酵解路线丙酮酸的合成，同期将酒精脱氢酶ADH1、ADH4失活以减少酒精的产生，促进丙酮酸脱氢酶旁路乙酰辅酶A的合成，进而将正丁醇产量提升了4倍以上。
另外，高效利用线粒体中乙酰辅酶A亦然提升萜类化合物产量的有用技巧。在S. cerevisiae中，乙酰辅酶A代谢在不同的细胞器完成，乙酰辅酶A存在于细胞质、线粒体、过氧化酶体及细胞核4个不同的细胞器，主要存在于细胞质和线粒体。且乙酰辅酶A无法目田穿梭于不同的细胞器之间，因此线粒体中的乙酰辅酶A不成穿膜投入细胞质，这就导致细胞质的乙酰辅酶A不大略多量积蓄。线粒体中的乙酰辅酶A不成穿梭到细胞质中，但是线粒体中的柠檬酸不错通过柠檬酸转运系统穿过线粒体到细胞质中，在ATP-柠檬酸裂解酶(ATP-citrate lyase， ACL)的作用下与CoA生成乙酰辅酶A和草酰乙酸[60]，盘曲地结束将线粒体中的乙酰辅酶A转运至细胞质中。
但是，S. cerevisiae自己不存在ACL。Lian等[56]通过引入着手于解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)的ACL，将柠檬酸解析为乙酰辅酶A和草酰乙酸，促进细胞质中乙酰辅酶A积蓄，进而将正丁醇的产量提升了2倍。Yu等[57]也在产脂肪酸的S. cerevisiae工程菌株中引入了构巢曲霉(Aspergillus nidulans)着手的ACL，重构了乙酰辅酶A的合成路线，并联接亚细胞代谢运载、NADPH和ATP的供应等计策，最终将脂肪酸的产量提升至33.4 g/L。
但是，胞质中的柠檬酸投入乙醛酸轮回，生成乙醛酸，乙醛酸在苹果酸合成酶MLS1的催化作用下和乙酰辅酶A进一步生成苹果酸，并投入过氧化物酶体，会导致乙酰辅酶A分流。为了减少乙酰辅酶A的猝然，Zhang等[13]敲除CIT2、MLS1的编码基因，使得柠檬烯产量分手提升了33.32%和140.30%。Chen等[61]将胞质中的苹果酸合成酶编码基因MLS1和过氧化物酶体中的柠檬酸合酶编码基因CIT2同期敲除，使得α-檀香烯产量提升了4倍。伏贝贝[12]引入着手于Y. lipolytica的ACL，并敲除了乙醛酸轮回中的异柠檬酸裂解酶编码基因ICL1，发现与对照菌株比拟，香叶醇的产量和产率分手提升了34%和83%。
研究东谈主员还通过在S. cerevisiae中构建外源的磷酸转酮酶(phosphoketolase， PK)路线，强化细胞内乙酰辅酶A的供应[62]。PK路线存在于酵母和乳酸菌中，并参与异型乳酸发酵[63-64]。PK大略催化6-磷酸果糖、5-磷酸木酮糖生成乙酰磷酸(acetylphosphate， ACP)，随后ACP在磷酸转乙酰酶(phosphotransacetylase， PTA)的作用下生成乙酰辅酶A[59， 65-66]。该路线不会亏欠碳，猝然1分子葡萄糖，生成3分子的乙酰辅酶A，因此有望用于提升产率[67]。Qin等[62]通过引入来自肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)的PK和来自克氏梭菌(Clostridium kluyveri)的PTA在S. cerevisiae中构建了PK路线，优化了S. cerevisiae的乙酰辅酶供应才能。Meadows等[58]在S. cerevisiae中在摈斥胞质乙酰辅酶A自然着手的基础上构建了一条异源的PK路线，再引入乙酰化乙醛脱氢酶ADA和NADH特异性的羟甲基戊二酰辅酶A (hydroxymethylglutaryl-CoA， HMG-CoA)复原酶，不但强化了细胞内乙酰辅酶A的供应，何况从头纠合了S. cerevisiae的中心碳代谢，改善路线氧化复原均衡，减少75%氧气猝然的同期将法尼烯产量提升了25%，200 000 L工业生物反馈器中发酵2周后法尼烯浓度特出130 g/L，显耀提升了法尼烯的工业坐蓐效率。Dai等[68]利用浅绿气球菌(Aerococcus viridans)的丙酮酸氧化酶(pyruvate oxidase， PO)和S. enterica的PTA构建了一条不依赖于ATP的路线，替代丙酮酸脱氢酶旁路来合成乙酰辅酶A，坐蓐了20.5 mg/L的法尼烯。
此外，泛酸在泛酸激酶的催化下也能生成乙酰辅酶A。Wegner等[69]通过补充泛酸并过抒发泛酸激酶CAB1来加多乙酰辅酶A的生物合成，使甲羟戊酸产量加多到3 830 mg/L，与对照比拟加多了12%。
2.1.2 强化MVA路线S. cerevisiae中MVA路线动作萜类合成中的第二个阶段，在迷惑上游的乙酰辅酶A流向萜类合成的同期，为后续反馈提供前体物资IPP和DMAPP (图 4)。因此，强化MVA路线对于提升萜类化合物产量十分伏击。现时，强化MVA路线的研究主要会聚在两方面：一是通过酶工程校正并过抒发MVA路线中关键酶，尤其是限速酶HMG-CoA复原酶(HMG-CoA reductase， HMGR)和异戊烯焦磷酸异构酶(isopentenyl diphosphate isomerase， IDI1)，告成提升前体物资的合成才能，显耀影响S. cerevisiae中萜类化合物的产量；二是通过辅因子工程提升S. cerevisiae中NADPH的供应水平，提升关键限速酶HMGR的催化活性，盘曲促进S. cerevisiae中前体物资的合成，大略有用促进细胞中萜类化合物的生成。
HMGR大略催化HMG-CoA合成甲羟戊酸，是MVA路线的关键限速酶之一，校正并过抒发HMGR大略有用强化MVA路线。研究标明，S. cerevisiae中的HMGR是一组同工酶HMG1和HMG2，尽管两者都由一个锚定跨膜结构域和一个催化结构域构成，但是HMG1性质踏实，而HMG2则容易赶快降解[70]。因此，在MVA路线发达作用的是HMG1。研究标明，过抒发截短的HMG1 (tHMG1)不错撤消MVA路线和麦角甾醇路线的反馈遏制[71-72]。Amiri等[73]通过过抒发tHMG1使芳樟醇的产量加多了50%以上。Liu等[74]过抒发tHMG1使香叶醇的产量加多到1.57 mg/L，与亲本菌株比拟，产量提升了1.38倍。Meng等[75]发现tHMG1过抒发大略大大增强瓦伦烯的合成，使瓦伦烯的产量提升了9倍以上。此外，Lu等[76]还发现着手于粪肠球菌(Enterococcus faecalis) MvaE的HMGR截短后的活性高于S. cerevisiae的HMG1，是现时增强MVA路线通量最有用的HMGR，大略将工业酵母菌株中角鲨烯含量提升9倍。
IDI能催化IPP与DMAPP之间相互荡漾，是MVA路线中另一个关键的限速酶[74]。因此，对IDI进行优化也有助于强化MVA路线。Liu等[74]使用多拷贝质粒过抒发IDI时产生1.62 mg/L的香叶醇，较胜本菌株提升了1.45倍。Chen等[78]摄取易错PCR对S. cerevisiae的IDI活性进行优化，通过3轮PCR筛选出L141H、Y195F和W256C这3个突变位点，突变体IDI的抒发使得番茄红素产量加多了1.8倍。
过抒发tHMG1和IDI突变体是强化MVA路线最常用的两种计策。但是MVA路线的其他酶，如乙酰乙酰辅酶A硫解酶(acetoacetyl-CoA thiolase， ERG10)、羟甲基戊二酰辅酶A合成酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A synthase， ERG13)、甲羟戊酸激酶(mevalonate kinase， ERG12)、甲羟戊酸-5-磷酸激酶(phosphomevalonate kinase， ERG8)以及甲羟戊酸-5-焦磷酸脱羧酶(mevalonate diphosphate decarboxylase， ERG19)，亦然生物合成前体物资IPP和DMAPP所必需的，过抒发这5种酶有助于强化MVA路线，加多IPP和DMAPP的供应。Wang等[49]通过过抒发ERG10、ERG8和ERG13，使五环三萜类的甘草次酸加多了1.5倍。Utomo等[79]发现不仅tHMG1的过抒发不错提升紫杉二烯的产量，ERG13、ERG12和ERG8的过抒发也不错加多萜类路线的总流量，促进S. cerevisiae中紫杉二烯的合成。Yuan等[80]检测到过抒发ERG10、ERG13、tHMG1和ERG12的突变株中紫杉二烯产量是亲本菌株产量的13倍以上。
此外，由于NADPH是MVA路线关键限速酶HMGR的辅因子，参与甲羟戊酸的合成，其供应水平影响HMGR催化活性，极大截至了MVA路线的代谢通量[81]。通过辅因子工程提升细胞中NADPH的合成和再生亦然加多MVA路线代谢通量和坐蓐效率的有用计策[20， 82]。NADPH的合成和再生取决于NADP+依赖性脱氢酶和NADH激酶的活性。酵母中存在多条NADP+依赖性脱氢酶起作用的胞质NADPH再生路线，包括异柠檬酸脱氢酶Idp2、乙醛脱氢酶Ald6、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶ZWF1、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶GND1等。其中ZWF1和GND1场所的磷酸戊糖路线是S. cerevisiae中NADPH形成的主要路线，ZWF1和GND1在磷酸戊糖路线的氧化阶段将NADP+荡漾为NADPH，1分子葡萄糖在磷酸戊糖氧化阶段大略生成2分子NADPH[83-84]。Kim等[84]发现过抒发ZWF1不错将NADPH浓度加多1.4倍。Shi等[85]通过过抒发ZWF1使倍半萜内酯小白菊内酯产量提升了75.28%。Kong等[32]通过过抒发ZWF1和GND1强化磷酸戊糖路线NADPH的供应，使柠檬烯产量从889.54 mg/L加多到903.86 mg/L。另外，过抒发磷酸戊糖路线中编码转醛酶的TAL1和编码转酮酶的TKL1，加多磷酸戊糖路线前体供应等计策也大略影响该路线NADPH的供应水平[86]。Kong等[32]在过抒发ZWF1和GND1的基础上，同期过抒发TAL1和TKL1以增强磷酸戊糖路线，将柠檬烯产量从903.86 mg/L提升到924.87 mg/L，并通过敲除谷氨酸脱氢酶编码基因GDH1、GDH2将柠檬烯的产量进一步提升了18.7%，达到1 097.43 mg/L。Kwak等[87]利用磷酸果糖激酶PFK的突变积蓄磷酸戊糖路线氧化阶段的前体物资葡萄糖-6-磷酸，过抒发突变的PFK和ZWF1使紫穗槐二烯的产量提升了3.7倍。Qin等[62]则是用一系列弱启动子取代糖酵解中磷酸葡萄糖异构酶Pgi1的自然启动子来裁减PGI1的抒发，削弱竞争路线对葡萄糖-6-磷酸的猝然，加多磷酸戊糖路线葡萄糖-6-磷酸的供应。Kim等[84]过抒发ZWF1，并用崇拜合成NADPH的ALD6取代参与NADH生成的ALD2基因，使原东谈主参二醇的产量加多了11倍。Huang等[88]引入来自变形链球菌(Streptococcus mutans)的NADP+依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPN，并过抒发ZWF1以加多NADPH的供应，将甘草次酸的产量提升了1.4倍。Yu等[89]则通过感性想象对细胞代谢网罗进行重构，在酵母细胞内构建了由磷酸戊糖轮回、转氢轮回和外部呼吸链3个模块构成的合成能量系统，将磷酸戊糖路线的氧化阶段、非氧化阶段以及部分糖异生相联接，使6-磷酸葡萄糖在氧化阶段被催化为5-磷酸核糖，生成2分子NADPH，C5分子投入非氧化阶段后经可逆重排，最终重构为6-磷酸果糖和3-磷酸甘油醛，3-磷酸甘油醛经部分糖异生路线回到6-磷酸葡萄糖，再一次投入氧化阶段，形成轮回，在这个轮回中，1分子葡萄糖透彻氧化不错生成12分子NADPH，大大提升了NADPH的供应水平。NADH激酶POS5是S. cerevisiae中NADPH的另一个主要供应源，在从ATP荡漾为ADP的经由中不错将NADH荡漾为NADPH，过抒发POS5也不错改善NADPH供应。Wang等[90]单独过抒发POS5将香叶醇的产量提升了25%，同期过抒发POS5和ZWF1将香叶醇的产量提升了约50%，香叶醇产量从97.00 mg/L加多到158.10 mg/L。除了告成过抒发参与NADPH合成的酶的基因以外，还不错通过调控转录因子盘曲影响参与NADPH合成的酶基因的抒发。Stb5是一种转录因子，大略调控与NADPH产生关联的基因的抒发[91]。Hong等[6]通过Stb5编码基因的过抒发，合成了41.8 mg/g的番茄红素，比对照菌株的番茄红素产量特出约1.5倍。
2.1.3 调控麦角甾醇合成路线如图 5所示，S. cerevisiae细胞中的麦角甾醇合成路线为其合成萜类化合物提供了告成前体物资牻牛儿基焦磷酸GPP、法尼基焦磷酸FPP以及2， 3-氧化鲨烯。因此，调控麦角甾醇合成路线中GPP、FPP、2， 3-氧化鲨烯等前体物资的供应水平亦然加多萜类物金钱量的一个伏击念念路。
GPP是合成单萜化合物的告成前体。如图 5所示，GPP是由法尼基焦磷酸合成酶(FPP synthase， ERG20)催化合成的。ERG20是S. cerevisiae细胞合成麦角甾醇的关键酶，而麦角甾醇是维生素D2的前体，亦然守护膜渗入性和流动性所需的细胞膜的伏击因素，因此酵母细胞滋长离不开ERG20[92]。ERG20动作一个双功能酶，既有GPP合成活性又有FPP合成活性。在S. cerevisiae中，GPP和FPP的合成均由ERG20催化完成，它大略在催化IPP与DMAPP生成GPP后，赓续催化GPP与IPP生成FPP[22]。GPP和FPP分手是合成单萜、倍半萜的告成前体，其供应量会告成影响这些萜类化合物的产量。过抒发ERG20大略促进FPP的合成[93]。但是在单萜合成经由中，由于GPP与ERG20的活性位点联接得很是精细，大部分GPP在ERG20的作用下被进一步荡漾为FPP，而不会被开释出来用于单萜的合成，这极地面截至了GPP的供应水平[94]。现时，利用卵白质工程等技巧校正S. cerevisiae内源的ERG20是促进GPP的积蓄、增强GPP供应的主要计策。Fischer等[95]发现当S. cerevisiae的ERG20在K197位置的催化位点发生氨基酸突变时，GPP积蓄显耀加多。Liu等[74]通过过抒发ERG20K197G增强了香叶醇合酶隔壁的GPP供应，使香叶醇产量提升了2.6倍以上，达到36.04 mg/L。Ignea等[94]发现F96、A99、N127亦然ERG20的关键活性位点，并通过对这3个位点进行了一系列的氨基酸突变，将ERG20转变成GPP合成酶，其中ERG20F96W和ERG20N127W大略将桧烯产量分手提升3.53倍和6.12倍，而F96和N127双位点突变的ERG20F96W-N127W则能使桧萜产量提升10倍以上，随后该团队进一步将工程化的ERG20荡漾为显性负型，裁减了内源性ERG20动作FPP合成才能，且不影响甾醇的生物合成。陈天华等[96]在合成单萜蒎烯时，一方面抒发内源ERG20的突变体ERG20ww以加多GPP的供应，另一方面，为了确保麦角甾醇的合成，将内源基因erg20的启动子原位替换为葡萄糖迷惑型启动子HXT1，下调ERG20的抒发，使蒎烯的产量提升了26.0%，并优化发酵工艺，使蒎烯产量达11.7 mg/L。此外，Zhao等[15]使用HXT1启动子代替ERG20启动子，同期对碳源葡萄糖和酒精的比例进行优化，也大略促进单萜的合成，将香叶醇的产量提升了3.8倍。
GPP在ERG20的催化下进一步荡漾为FPP，而FPP供应水平不仅受到ERG20的影响，还会受到角鲨烯合酶(squalene synthase， ERG9)和牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(GGPP synthases， GGPPS)的影响。其中，ERG9是三萜和麦角甾醇生物合因素支路线中的第一个酶，其高抒发会猝然多量的FPP，减少了GGPP坐蓐的前体供应。但是由于麦角甾醇是S. cerevisiae细胞滋长所必需组分，而ERG9对麦角甾醇的生物合成至关伏击，因此在弱化竞争路线时，多摄取下调erg9基因抒发，保证麦角甾醇合成的同期，下调了其代谢通量。不时用可调控的MET3启动子取代erg9的自然启动子，再用甲硫氨酸下调erg9的抒发。Promdonkoy等[97]通过启动子工程下调erg9的抒发，合成了12.1 mg/L的α-檀香烯，将α-檀香烯产量提升了94%。研究标明，下调erg9的抒发后，芳樟醇、紫穗槐-4， 11-二烯等萜类化合物的产量也得到了明白的改善[33， 73]。Hu等[39]通过敲除erg9启动子的上游激活序列(upstream activation sequence， UAS)来遏制erg9的抒发，从而促进二萜次丹参酮二烯的积蓄。此外，Peng等[98]迷惑了一种卵白质去踏实性的步调，建筑了一种PEST (富含Pro、Glu/Asp、Ser和Thr)序列依赖性内质网关联卵白降解(endoplasmic reticulum-associated protein degradation， ERAD)机制，也大略裁减erg9的抒发水平，可将反式-橙花叔醇的产量提升86%。对倍半萜而言，不仅麦角甾醇生物合因素支路线会猝然多量的FPP，S. cerevisiae细胞内源的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶BTS1也会减少FPP的积蓄[79]。因此，敲除酵母GGPPS的编码基因bts1也大略加多萜类化合物产量。陈和锋[18]在合成倍半萜瓦伦烯时，不仅下调了erg9的抒发，还敲除了bts1，大大促进了关键前体物资FPP的积蓄，有用提升了瓦伦烯的产量。值得正式的是，FPP具有细胞毒性，其过度积蓄会遏制细胞滋长，进而影响萜类化合物的高效合成[99]。为了均衡细胞滋长和FPP供应，Dahl等[100]应用全基因组转录物阵列来识别对FPP的积蓄有反馈的启动子，将其整合到紫穗槐二烯合成路线，通过反馈诊治动态调控FPP的积蓄并将紫穗槐二烯的产量提升了2倍。
此外，由图 5不错看出，FPP在ERG9的催化作用下还不错生成角烯鲨，随后在鲨烯环氧化酶(squalene epoxidase， ERG1)的催化作用下生成2， 3-氧化鲨烯，2， 3-氧化鲨烯在萜类合成酶和修饰酶的作用下进一步形成多种种种的三萜类化合物。因此，调控ERG9、ERG1的抒发，加多三萜类化合物前体物资角烯鲨和2， 3-氧化鲨烯的供冒昧于提升三萜类化合物的产量尤为伏击。Zhang等[101]引入E. coli的IDI1，并通过过抒发idi1、erg20、erg9的基因来提升前体角鲨烯的供应，将β-香树脂醇的产量提升了49倍。此外，由于S. cerevisiae的ERG1活性较低，截至了后续居品的合成[102]。Zhang等[101]引入并过抒发了白色念珠菌(Candida albicans)着手的ERG1，有用地将角鲨烯荡漾为2， 3-氧化鲨烯，用于合成β-香树脂醇。高惠芳等[47]通过过抒发ERG20和ERG1的编码基因，将熊果酸、白桦脂酸、摩尔酸的产量分手从41.4、16.5、24.3 mg/L提升到62.5、26.7、34.1 mg/L。Wang等[49]轮廓利用强化MVA路线(过抒发ERG10、ERG8、ERG13、tHMG1)，过抒发ERG20、ERG9、ERG1编码基因等计策，将甘草次酸的产量提升了5倍。合成三萜化合物时，下调麦角甾醇合成路线中的erg7，减少2， 3-氧化鲨烯的猝然亦然常用的调控计策[43]。Bröker等[46]使用CTR3启动子取代ERG7的启动子，遏制了erg7的抒发，积蓄了2， 3-氧化鲨烯，进而使羽扇豆醇含量加多7.6倍。Li等[103]利用MET3启动子下调erg7的抒发，将更多的碳流量转机到白桦脂酸的生物合成中。
2.1.4 代谢通量调控ROX1、MOT3、UPC2等全局转录因子大略对所有这个词路线的代谢通量进行调控[104]。其中转录遏制因子rox1和mot3基因大略遏制MVA路线和麦角甾醇合成路线中关联基因的抒发[105-106]。Özaydın等[107]合成倍半萜烯醇红没药烯时，敲除rox1基因，将红没药烯产量提升了2倍。Bröker等[46]过抒发tHMGR和HMGS的同期，敲除ROX1，使角鲨烯含量加多8.2倍，羽扇豆醇的产量提升16.5倍。杨婷婷等[108]敲除rox1，将瓦伦烯的产量提升了17.4%。Hongay等[106]发现敲除mot3基因后，总甾醇和总麦角甾醇的产量分手提升了21%和15%。焦学[109]同期敲除rox1和mot3，所得菌株中生养三烯酚产量从17.92 mg/g提升到19.24 mg/g。Hong等[6]敲除rox1或mot3基因，均提升了番茄红素的产量。而过抒发麦角甾醇生物合成的全局转录因子UPC2不错增强MVA路线[110]。Zhang等[101]在过抒发MVA路线中的关键酶基因的基础上，加强了转录因子UPC2与启动子的联接，强化了工程路线的定向转录调控，将β-香树脂醇的产量提升了65倍，同期使用酒精补料分批发酵，最终将β-香树脂醇产量提升到138.80 mg/L。
敲除dos2、ypl062w、yjl064w等远端遗传基因也大略提升萜类化合物的产量。Chen等[111]将dos2敲除后，番茄红素产量加多了5.7%。Özaydın等[107]将ypl062w、yjl064w两个基因敲除后，红没药烯的产量提升了近3倍。Trikka等[112]建筑并应用了杂合缺失筛选来识别截至类胡萝卜素和二萜产量的基因，发现敲除rox1、dos2、yer134c、vba5、ynr063w和ygr259c这6个基因将二萜化合物香紫苏醇的产量提升了12倍，将类胡萝卜素产量提升了40倍。
此外，跟着组学时间的发展，研究东谈主员也开动通过代谢网罗的计较、模拟和预测从复杂细胞代谢网罗中筛选关键基因进行调控，在确保胞内代谢通量均衡的基础上，为萜类化合物合成路线分派最大的代谢通量[42]。将基因组范畴代谢网罗GSMM与基因敲除预测算法OptKnock相联接，快速预测了甜茶苷坐蓐工程菌株中的基因敲除靶点，通过优化与代谢流再分派后，甜茶苷在摇瓶中的产量从205.5 mg/L提升到302.1 mg/L。Paramasivan等[113]利用GSMM和FOCuS算法进行预测，筛选出脂肪酸生物合成、氨基酸合成、核苷酸生物合成等多个路线的一些关键敲除靶点，包括LYS1、GAP1、AAT1、AAT2、TH17、KGD-m、MET14、PDC1和ACO1，使用FSEOF等算法筛选出过抒发靶标，如PFK1、FBA1、ZWF1、TDH1、PYC1、ALD6、TPI1、PDX1和ENO1，并进行考据，与对照组比拟，角鲨烯的合成量加多了4.24倍。
2.2 萜类合成酶的优化 2.2.1 不同着手萜类合成酶筛选尽管S. cerevisiae细胞内存在的MVA路线和麦角甾醇路线为萜类化合物的合成提供了可能，但由于枯竭萜类合成关联酶，无法合成相应的萜类化合物，因而需要东谈主为引入相应的外源萜类合成酶。Amiri等[73]通过引入薰衣草(Lavandula angustifolia)着手的芳樟醇合成酶基因LIS，结束了芳樟醇在工程S. cerevisiae中的坐蓐，产量最高可达95 μg/L。Baadhe等[33]在构建产紫穗槐-4， 11-二烯的工程S. cerevisiae时，利用着手于Artemisia annua L.的紫穗槐二烯合酶ADS将FPP荡漾为紫穗槐二烯。Yu等[43]将苹果(Malus×domestica)着手的α-香树脂醇合酶MdOSC1引入S. cerevisiae中，并在此基础上增强2， 3-氧化鲨烯的供应，将α-香树脂醇的产量提升到11.97 mg/L，是之前报谈的最高产量的5.8倍。
萜类合成酶的着手粗拙，其催化性能与酵母细胞中萜类化合物的坐蓐效率息息关联。一方面，不同着手的萜类合成酶会合成对映体特异性不同的居品[114]。着手于紫苏(Perilla frutescens)的柠檬烯合成酶主要坐蓐(－)-柠檬烯[115]，而着手于L. angustifolia的柠檬烯合成酶主要坐蓐(+)-柠檬烯[116]。另一方面，不同着手的萜类合成酶的催化效率也存在互异。付闻文等[117-118]比较了甜橙、木豆、大豆3种不同着手的法尼烯合成酶，发现抒发不同着手的法尼烯合成酶后，法尼烯产量互异较大，最高可达148.34 mg/L，最低的仅为46.39 mg/L。因此，遴选合乎的萜类合成酶对于萜类物资的合成十分关键。
2.2.2 萜类合成酶的校正当异源的萜类合成酶在S. cerevisiae中抒发时，使用加多拷贝数、使用强启动子等常用技巧来提升萜类合成酶的抒发效率并不成从根底上搞定酶催化效率低、特异性差等问题，通过定向进化、半感性想象、感性想象对酶活性位点进行校正，可能是进一步增强其催化效率的有用路线。Tashiro等[119]通过单轮诱变和筛选取得了蒎烯合成酶的突变体，与野生型的蒎烯合成酶比拟，突变后的蒎烯合成酶将蒎烯产量提升了60%。Zhou等[120]以番茄红素为指令剂，迷惑了一种用于芳樟醇合成酶定向进化的高通量筛选步调，筛选的t67OMcLISE343D/E352H将芳樟醇的产量提升了52.7%。Zhang等[121]将多变鱼腥藻(Anabaena variabilis)的AvGAS、念珠藻(Nostoc carneum)的NcGAS、念珠藻(Nostoc sp.) PCC 7120的NsGAS的序列进行比对，筛选出可能提升催化活性的位点进行突变，其中AvGAS-F23W和AvGAS-F33V突变分手将吉玛烯A产量提升了35.2%和21.8%。
jav黑丝另外，超微结构关联性研究、特异性标志和亚细胞分级研究标明，单萜生物合成的早期步调发生在质体中。单萜合成酶前体卵白的N端存在转运肽，不错将翻译后的卵白质靶向质体[122]。单萜合成酶转入质体后，N端转运肽会被水解去除[123-124]。但是当单萜合成酶在微生物中进行抒发时，N端转运肽不成被正确水解，导致酶定位雄壮，干预酶的正确折叠，进而影响酶的催化功能。因此，在S. cerevisiae中抒发单萜合成酶时，截短其N端转运肽大略有用提升单萜合成酶的活性。Jiang等[11]从9种不同的香叶醇合酶(geraniol synthase， GES)中筛选出最优的香叶醇合酶GrGES (着手于长春花Catharanthus roseus)，在S. cerevisiae中结束了香叶醇的合成，香叶醇产量为43.19 mg/L，再通过截短CrGES的N端转运肽，进一步将香叶醇产量提升至191.61 mg/L。陈天华等[96]在S. cerevisiae中抒发了ERG20的突变体ERG20ww，并引入来自火把松(Pinus taeda)的蒎烯合酶PtPS，构建了蒎烯的合成路线，在此基础上通过截短PtPS N端2−51位的氨基酸残基，将蒎烯产量提升了2.23倍。
2.2.3 卵白和会卵白和会亦然调控代谢通量的有用计策。研究标明，卵白和会不错保抓酶高催化活性，且不会影响酶的生物合成[125-126]。此外，利用卵白和会还大略加多关键中间体的有用浓度，减少竞争旅途对于中间体的猝然，进而优化居品的坐蓐水平[127-128]。Albertsen等[129]将ERG20与广藿香合成酶PTS偶联，和会卵白在S. cerevisiae中的抒发使广藿香醇的产量加多了2倍。Ignea等[94]通过ERG20突变体与萜烯合酶和会，裁减酵母细胞内野生型erg20抒发水对等计策，使桧烯的产量比肇端菌株提升了340倍。Baadhe等[33]摄取和会卵白时间，将ERG20与紫穗槐二烯合成酶ADS偶联，使S. cerevisiae中紫穗槐二烯的产量提升了4倍。Jiang等[11]在截短香叶醇合酶CrGES的N端转运肽基础上，将截短的CrGES和ERG20WW进行和会抒发，进一步将香叶醇产量从191.61 mg/L提升到523.96 mg/L。陈天华等[96]将ERG20WW和截短的蒎烯合酶和会抒发，使蒎烯产量提升了5.16倍。
卵白和会抒发时，不时需要加入linker限定酶与酶之间的空间距离，减少不同酶在催化经由中的相互干预[130-131]。Promdonkoy等[97]使用GGGGS动作linker将FPPS和萜烯合成酶ClTPS2进行和会抒发，相较于单独过抒发FPPS和ClTPS2，加多25.8%。Zhang等[29]应用GSGSGSGSGS扣问将ERG20F96W-N127W与tVvTS和会，与亲本菌株比拟，和会卵白使α-萜品醇的产生加多了2.87倍，达到2.39 mg/L。值得正式的是，在使用GS纠合肽时，卵白和会的国法对和会酶的抒发有显耀影响。Jiang等[11]对截短的香叶醇合酶CrGES和ERG20ww分手进行了正向和会和反向和会，发现反向和会不错增强CrGES对前体GPP的可及性，促进香叶醇的合成。Hu等[39]在将毛喉鞘蕊花(Coleus forskohlii)着手的CfTPS1和丹参(Salvia miltiorrhiza)着手的SmKSL1和会抒发，并通过该和会二萜合酶催化GGPP生成次丹参酮二烯时，也发现卵白和会的国法对居品的生成影响显耀，抒发和会模块CfTPS1-SmKSL1的菌株次丹参酮二烯产量为70.5 mg/L，而抒发和会模块SmKSL1-CfTPS1的菌株次丹参酮二烯产量达到313.4 mg/L。
除了常用的GS纠合肽，也不错通过短肽标签RIAD和RIDD来构造无支架和会卵白，使两种和会的酶自愿形成1:2的复合物，从而优化和会卵白中两种酶的比例，Kang等[132]以RIAD和RIDD这一双短肽标签创建了无支架的和会卵白，使工程S. cerevisiae中番茄红素产量加多了58%。近期，Sun等[133]受到Ⅰ型模块化聚酮合酶(polyketone synthase， PKS)的启发，模拟了自然模块聚酮合酶的有序拼装，迷惑了一种名为“模拟PKS酶活水线(mimic PKS enzyme assembly line， mPKSeal)”的多酶拼装计策，利用Ⅰ型顺式-AT聚酮合酶对接域将虾青素生物合成路线酶进行多酶拼装，使虾青素产量提升2.4倍，产量达16.9 mg/g DCW，有用提妙手工细胞工场的合成效率。
2.3 细胞色素P450酶的抒发和优化细胞色素P450 (CYPs或P450)的修饰是变成萜类化合物结构种种的主要原因之一。P450大略催化多种代谢反馈，包括C–C键断裂、C=C双键的环氧化、环修饰、脱氨基、脱烷基、脱羧，以及重排反馈等[134]。Guo等[135]利用CYP76AH3和CYP76AK1两个酶介导的氧化、杂环化、芳构化和去甲基化等多种反馈将次丹参酮二烯进一步催化生成6种丹参酮单体。因此，P450在S. cerevisiae细胞中的高效抒发是异源合成萜类化合物的伏击环节。
与E. coli比拟，S. cerevisiae精熟的翻译后修饰才能和好意思满的细胞器系统为P450酶的抒发和催化反馈提供了很好的环境。现时，S. cerevisiae如故奏效抒发了多种具有功能活性的异源P450酶。举例，Li等[136]在产β-香树脂醇的S. cerevisiae细胞中引入来自光果甘草(Glycyrrhiza glabra)的CYP93E3和CYP72A566，合成了8.36 mg/L三萜类化合物大豆皂醇B。Wong等[137]通过抒发缬草-4， 7(11)-二烯合酶VDS，将FPP荡漾为缬草-4， 7(11)-二烯，进一步筛选并引入P450酶VoCYP71DJ1，奏效合成了倍半萜缬草酸。此外，由于P450的催化反馈是在着手于NADPH的电子当量驱动下激活的，同期还需要氧化复原伴侣CPR摄取并传递电子，而不同着手的CPR与P450酶之间的适配性大略影响电子传递效率，截至P450酶的催化效率[138]。因此，在抒发P450时还需要同期抒发合乎的CPR。高惠芳等[48]比较了着手于C. roseus的P450酶CYP716AL1和着手于麻风树(Jatropha curcas)的JcCPR、着手于拟南芥(Arabidopsis thaliana)的AtCPR、着手于百脉根(Lotus japonicas)的LjCPR、着手于甘草(Glycyrrhiza uralensis)的GuCPR以及着手于苜蓿(Medicago truncatula)的MtCPR等不同着手的CPR的适配性，发现CYP716AL1和AtCPR共抒发时摩尔酸产量最高，可达到24.3 mg/L。Zhao等[139]通过在产β-香树脂醇的S. cerevisiae细胞中引入来自M. truncatula的皆墩果酸合成酶MtCYP716A12和细胞色素复原酶MtCPR，构建了产皆墩果酸的工程菌株，并对其生物合成路线进行优化，产量最终可达606.9 mg/L。
卵白质工程是提升P450/AtCPR催化效率的主要技巧。Urlacher等[140]通过两轮易错PCR对野生型CYP102A1进行当场突变，产生的三重突变体A74E F87V P386S对β-紫罗兰酮的羟基化活性加多了300倍(与野生型比拟)。Sun等[141]通过同源性建模和分子对接详情了影响酶与底物疏水相互作用的关键残基，基于合理遴选的残基进行计较率领突变，将混合的CYP72A63重塑为可控的催化剂突变体CYP72A63 (T338S)，结束了甘草次酸的特异性坐蓐。Zhao等[142]在异源合成原东谈主参二醇时，明天自东谈主参(Panax ginseng)细胞色素P450型原东谈主参二醇合酶PPDS与A. thaliana的P450复原酶ATR1进行和会，与PPDS和ATR1共抒发比拟，和会酶的催化活性加多了约4.5倍，原东谈主参二醇的产生加多了71.1%。
P450/AtCPR不时定位在内质网上，这亦然导致其低催化效率的原因之一。Xu等[41]在合成二萜酸甜菊醇时发现A. thaliana的P450酶KAH和来自甜叶菊(Stevia rebaudiana)的CPR1是通过跨膜结构域(transmembrane domain， TMD)共定位在酵母内质网上的，截去CPR1的TMD使P450模块进行细胞质抒发，大略有用搞定膜结构融化性差产生的酶低催化效率问题，将甜菊醇的产量加多了231.2%。Cha等[35]截短AtCPR的N-末端，圆柚酮产量提升了2倍以上。
2.4 区室化工程S. cerevisiae中存在许多伏击的细胞器，如线粒体、过氧化物酶体、内质网等。这些细胞器的结构和功能各有不同，却粗拙散布着合成萜类化合物所需要的前体、酶和辅因子。合理迷惑和校正S. cerevisiae的细胞器，将代谢路线区室化，不但不错加多酶和底物的局部浓度，提升细胞内萜类化合物的合成效率，还不错减少萜类化合物对细胞的毒性，对于提升S. cerevisiae萜类化合物合成才能具有精熟的应用远景[143]。
2.4.1 关键酶线粒体定位在线粒体中，TCA轮回大略产生多量的乙酰辅酶A和ATP可用于萜类化合物合成，何况线粒体膜的存在幸免了中间体流向竞争路线[144]。这就为利用线粒体区室从线粒体乙酰辅酶A合成萜类化合物奠定了精熟的基础。Yuan等[144]将ERG10、ERG13、HMG1/2、ERG12、ERG8、ERG19、IDI1和ERG20等酶的编码基因定位到线粒体内，在线粒体中构建了FPP的生物合成路线，并引入紫穗槐-4， 11-二烯合成酶ADS的编码基因，初度在线粒体内合成了萜类化合物，坐蓐了427 mg/L的紫穗槐-4， 11-二烯。Yee等[145]将MVA路线定位到了S. cerevisiae的线粒体中，并在线粒体中构建香叶醇的生物合成路线，结束了香叶醇在线粒体内坐蓐，其产量是细胞质坐蓐香叶醇的6倍。Lv等[146]迷惑了同期利用细胞质和线粒体乙酰辅酶A合成异戊二烯的双重代谢工程，与仅包含线粒体或细胞质工程校正的重组S. cerevisiae比拟，该计策将异戊二烯产量分手提升2.1倍和1.6倍，充分标明利用线粒体合成萜类化合物具有巨大后劲。但是，IPP具有细胞毒性，在细胞质中不错通过角鲨烯合成等当然路线对IPP解毒，而线粒体枯竭猝然IPP的分支路线，其过度积蓄会导致细胞滋长遏制[99]。为了缓解线粒体工程菌株的滋长遏制，Yao等[147]在细胞质和线粒体乙酰辅酶A合成异戊二烯的双重代谢工程校正的基础上，将erg19和idi1引入细胞质和线粒体工程菌株中，使erg19和idi1以合理的拷贝数共抒发，重建代谢均衡，在不损伤细胞滋长的情况下显耀提升异戊二烯的产量，再联接异戊二烯合酶诱变等计策，将异戊二烯产量进一步提升到11.9 g/L。
2.4.2 内质网优化内质网与卵白质的合成、折叠谈论，同期也定位着多种与萜类合成关联的酶。内质网的体积空间影响其卵白质折叠才能，当折叠才能不成振奋卵白质的合成需求时，细胞通过延迟内质网、增大内质网体积空间以振奋其卵白质折叠才能。Kim等[148]通过过抒发一种脂质生物合成的转录因子INO2扩大S. cerevisiae的内质网，增强内质网卵白的合成和折叠才能，将角鲨烯和原东谈主参二醇的产量分手加多了71倍和8倍。Arendt等[149]发现通过CRISPR/Cas9浮松磷脂酸磷酸酶的编码基因PAH1会导致内质网的急剧延迟，影响三萜合成酶的生成，进而促进三萜类化合物的积蓄。Arendt等[149]利用该计策对内质网结构进行修饰，使三萜皂苷的产量提升了16倍，从而大大特出了先前报谈的产量。
2.4.3 脂滴的迷惑利用脂滴主要由三酰甘油(triacylglycerols， TAGs)和甾酯(steryl ester， SE)构成，具有中性脂质的亲脂性中枢，是脂质储存、脂类代谢的关键细胞器[150]。研究标明，S. cerevisiae的脂滴大略被迷惑授室脂性化合物的储存细胞器，储存α-香树脂醇、番茄红素、β-胡萝卜素、东谈主参皂苷等萜类化合物，有用缓解S. cerevisiae中萜类化合物生物合成中的抒发瓶颈，减轻萜类化合物对S. cerevisiae的细胞毒性[7， 143， 151-154]。
脂滴的工程化校正派略显耀提升萜类化合物的坐蓐水平。举例原东谈主参二醇合酶PPDS将达玛烯二醇Ⅱ (damene glycol Ⅱ， DD)荡漾为原东谈主参二醇(protoginseng glycol， PPD)是东谈主参皂苷合成路线中的关键步调。PPDS是一种细胞色素P450酶，位于酵母的内质网中，而PPDS的底物DD则储存在脂滴中。酶至极底物的区室化导致细胞的DD荡漾才能受限。Shi等[143]使用酵母PLN1卵白将平素内质网定位的PPDS靶向脂滴，将DD荡漾为PPD的效率显耀提升了394.0%，DD的荡漾率也从17.4%提升到86.0%。角鲨烯是三萜类化合物合成的关键前体，与三酰甘油、甾酯一皆储存在脂滴中[151-152]。Wei等[153]发现过抒发脂滴调控因子二酰甘油酰基转机酶DGA1，增强脂质的生物合成，提升角鲨烯的储存才能，不错进一步加多角鲨烯的产量。饶攀[155]通过过抒发DGA1，加多了S. cerevisiae内的脂滴数目和大小，增强了S. cerevisiae对萜类化合物的存储才能，将原东谈主参二醇产量提升了25%。赵一瑾[156]过抒发甾醇酰基转机酶ARE1和ARE2，加多细胞内SE的合成通量，加多脂滴的大小，将β-胡萝卜素产量高了54%，合成了5.67 mg/g β-胡萝卜素。
此外，α-香树脂醇、番茄红素等亲脂性萜类化合物，在高浓度下对细胞有毒，将其储存在脂滴中，大略有用缓解亲脂性萜类化合物对S. cerevisiae的细胞毒性，加多其的细胞内积蓄。Ma等[7]通过过抒发与脂肪酸合成和TAG产生关联的关键基因、过抒发脂肪酸去饱和酶基因以及敲除Seipin卵白编码基因等计策，诊治TAG构成和脂滴大小，将番茄红素储存在脂滴中，以幸免其关联的毒性，加多了番茄红素在细胞内积蓄，使得细胞内番茄红素产量提升了25%，达到70.5 mg/g。Yu等[154]基于建模分析取得的α-香树脂醇合酶三重突变体MdSOSC1N11T/P250H/P373A，将α-香树脂醇的产量提升了11倍，在此基础上，过抒发DGA1以扩大细胞内α-香树脂醇的储存才能，在补料分批发酵中坐蓐了1 107.9 mg/L的α-香树脂醇，比原始菌株提升了106倍。
3 提升S. cerevisiae对萜类化合物的耐受性S. cerevisiae对萜类化合物的耐受性差是截至其高产的另一个关键因素[12]。Brennan等[157]研究β-蒎烯、柠檬烯、月桂烯、萜品烯、γ-萜品烯等萜类对S. cerevisiae的最低遏制浓度(minimum inhibitory concentration， MIC)时发现，这些萜类化合物的MIC都很低，仅0.44 mmol/L的柠檬烯就大略显耀遏制S. cerevisiae的细胞滋长。
萜类化合物对细胞变成毒性的原因可能有以下4个方面：(1) 浮松细胞壁的好意思满性，遏制菌体滋长。Brennan等[158]用遏制量的d-柠檬烯处理S. cerevisiae细胞后，发现麦角固醇和脂肪酸生物合成路线的基因并未上调，细胞膜流动性、结构膜好意思满性、脂肪酸构成也未发生转变，但是细胞壁好意思满性信号通路的关联基因过抒发，细胞壁的结构和功能发生转变，细胞分裂受到遏制，且柠檬烯处理后的细胞对细胞壁降解酶的敏锐性加多。(2) 细胞膜功能受损。紫苏醇、d-柠檬烯等萜类，大略遏制S. cerevisiae MVA路线中HMG-CoA复原酶的活性，进而影响细胞膜的合成[159]。萜类不仅会影响细胞膜合成，还会损坏细胞膜功能，激励细胞凋一火。Liu等[160]用亚致死剂量的d-柠檬烯处理S. cerevisiae细胞，2 h后，发现S. cerevisiae细胞膜的膜流动性、渗入性和饱和脂肪酸比率加多，细胞存活率急剧着落。(3) 激励细胞内活性氧(reactive oxygen species， ROS)积蓄，导致细胞死字。Bakkali等[161]在实际药用植物精油对S. cerevisiae细胞毒性时发现，使用精油处理S. cerevisiae后，OH•和O2•−目田基以及H2O2等多量ROS在细胞内积蓄，严重影响细胞壁和细胞膜，并损伤线粒体DNA，导致线粒体功能清贫，进而引起细胞凋一火。(4) 遏制细胞内的能量代谢。Uribe等[162]研究了β-蒎烯对S. cerevisiae的影响，发现β-蒎烯大略遏制细胞呼吸和H+、K+的转运，阻难S. cerevisiae线粒体内ATP的生成。
为了裁减萜类化合物的细胞毒性，减少萜类化合物与酵母细胞的战争，研究东谈主员不仅利用脂滴包裹亲脂性萜类化合物[7， 154]，还摄取了两相溶剂萃取、离子交换平分离步调。Brennan等[157]通过两相溶剂萃取将d-柠檬烯等5种单萜转机至有机相，其中与无溶剂系统中的单萜比拟，邻苯二甲酸二丁酯中d-柠檬烯的MIC提升了702倍，同期S. cerevisiae细胞活力保抓在90%以上，减轻发酵经由中的萜类化合物毒性。Alonso-Gutierrez等[163]则摄取阴离子交换树脂进行原位居品回收，实时去除发酵经由中的萜类。
通过外排工程迷惑对细胞毒性具有更好耐受性的优良底盘，这亦然减轻萜类化合物对细胞毒性的有用计策[164]。外排工程是将异源合成经由中的有毒物资排出宿主，微生物中存在的自然的外排系统大略将细胞内的居品泵出细胞，以减轻居品对细胞的毒性[165]。通过引入异源的外排转运卵白结束S. cerevisiae内萜类化合物的外排是最常见的计策之一。Wang等[166]在S. cerevisiae中引入子囊菌Grosmannia clavigera的转运卵白GcABC-G1，并用d-柠檬烯、3-蒈烯、β-蒎烯等单萜对S. cerevisiae进行处理，发现GcABC-G1的异源抒发加多了重组S. cerevisiae对单萜的耐受性，提升了重组S. cerevisiae的存活率。Chen等[167]在S. cerevisiae均分手抒发了Y. lipolytica的ABC转运卵白ABC2和ABC3，用一系列烷烃处理后，发现重组S. cerevisiae中ABC2和ABC3转运卵白的转录加多，S. cerevisiae对烷烃的耐受性显耀提升，其中ABC2转运卵白的抒发使S. cerevisiae对癸烷的耐受限提升了约80倍。Demissie等[168]将薰衣草的ABC转运卵白LaABCB1导入酵母细胞中，发现LaABCB1的抒发增强了酵母对香叶醇的耐受性。利用内源性质膜ABC转运卵白亦然S. cerevisiae中萜类化合物外排的有用计策。通过转录组分析发现单萜会显耀迷惑4个质膜外排泵基因(YOR1、SNQ2、PDR5、PDR15)的抒发，质膜外排泵不错识别并列出对细胞具有毒性的物资。在过抒发SNQ2、PDR5后，S. cerevisiae细胞内的单萜含量明白着落[169]。Bu等[170]通过比较卵白质组学分析和转录组分析，详情了Pdr5、Pdr10、Snq2、Yor1、Yol075c等5种潜在的β-胡萝卜素外排的ABC转运卵白，摄取了迷惑型GAL启动子过抒发候选转运卵白，增强了β-胡萝卜素的分泌和细胞内坐蓐，其中Snq2的转运才能最佳，将菌株β-胡萝卜素的分泌量加多了4.04倍，细胞内的β-胡萝卜素产量也加多了1.33倍。近期，江南大学刘龙团队迷惑了一种萜类化合物转运卵白预测和挖掘框架，可用于识别萜类化合物的转运卵白，他们利用in-silico预测和挖掘S. cerevisiae中萜类化合物的转运卵白，通过“挖掘-对接-构建-考据”，发现ABC转运卵白Pdr5和氧固醇联接同源卵白Osh3大略促进角鲨烯的外排，过抒发Pdr5和Osh3的编码基因不错使角鲨烯的分泌量达86.10 mg/L，是对照菌株的141.1倍，过抒发Pdr10的编码基因不错使β-胡萝卜素分泌量加多到对照菌株的3.3倍，达41.05 mg/L，与基于转录组分析的传统研究步调比拟，该步调愈加省时、低资本[171]。刘龙团队还使用AutoDock Vina通过批量分子对接计较了39个萜类化合物的联接亲和力，探索Prd11对39个萜类化合物的运载后劲，并以角鲨烯、番茄红素和β-胡萝卜素为例进行实验考据计较机预测末端的准确性，讲明联接亲和力是筛选转运卵白底物的可靠参数，大略快速筛选天萜类化合物的转运卵白，为搞定细胞内过量积蓄引起的萜类化合物坐蓐瓶颈提供了新念念路[172]。
除了不错利用外排系统将异源合成经由中的有毒物资排出，通过耐受工程提升宿主对有毒物资的抗性亦然缓解单萜细胞毒性的有用步调。Chubukov等[173]在耐柠檬烯的E. coli中发现了一个烷基氢过氧化物酶的突变体AhpCL177Q，它大略将氢过氧化物复原为毒性相对较小的化合物，减轻了柠檬烯对细胞的毒性。Brennan等[174]则在柠檬烯威迫下，摄取连气儿分批转机的顺应性进化奏效地分离出了柠檬烯耐受表型的S. cerevisiae，并对其进行测序，末端透露Tcb2p和Tcb3p的编码基因发生突变，进一步进行耐柠檬烯表型的基因组重建，发现截短的Tcb3p (tTcb3p1-989)大略将细胞对柠檬烯的耐受性提升9倍，对β-蒎烯和月桂烯的耐受性分手提升11倍和8倍。Godara等[175]发当今氧化威迫下，S. cerevisiae的STE6基因发生突变，突变体中双环倍半萜β-石竹烯的产量提升了3.7倍，达到12.6 mg/g细胞干重，过抒发突变的STE6 (STE6 T1025N)可使β-石竹烯的产量加多4倍，达到13.8 mg/g DCW。Reyes等[176]也在氧化威迫下将β-胡萝卜素的产量加多了3倍，达到18 mg/g DCW。Jiang等[177]将快速常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma， ARTP)诱变与氧化威迫相联接，使虾青素产量从13.25 mg/L提升到65.93 mg/L，与亲本菌株比拟提升了近4倍。
4 忖度频年来，跟着合成生物学的迅猛发展，S. cerevisiae动作萜类化合物的坐蓐平台取得了巨猛进展，现已奏效合成香叶醇、法尼烯、紫杉二烯、甘草次酸、番茄红素等多种萜类化合物。研究东谈主员摄取代谢路线构建与优化、关键酶的挖掘与校正、辅因子再生工程、细胞区室化工程、细胞外排工程以及细胞耐受性校正等多种计策校正S. cerevisiae细胞陈凯歌 男同，以提升其萜类化合物的坐蓐才能，这些调控计策是通用的，不局限于特定的萜类化合物，将不同的计策组合哄骗，可进一步结束S. cerevisiae体内萜类化合物的高效抒发，推进萜类化合物的工业化坐蓐。但是，要结束萜类化合物的工业化坐蓐，坐蓐菌株的迷惑仅仅第一步，在后续摇瓶优化、实验室和中试发酵罐研究、工业范畴扩大的经由中仍存在诸多挑战，包括底物遴选、动力猝然、坐蓐工艺的连气儿性和再现性等[178]。现时大多数萜类化合物离工业化的坐蓐还有一定差距，亟需在记忆前东谈主磨真金不怕火和效率的基础上，通过深刻挖掘更多萜类化合物合成路线，联接基因工程、卵白质工程、代谢工程、合成生物学、发酵工程等多学科技巧构建高效、踏实、可控、低资本的产萜类居品S. cerevisiae细胞工场，以结束更多复杂萜类化合物的好意思满合成和范畴化坐蓐。